Лазерная спектральная и видеофлюоресцентная диагностика заболеваний желудка с 5-аминолевулиновая кислотой гидрохлорид (препарат Аласенс)
В.В. Левкин, С.С. Харнас, В.Я.Заводнов,Т.В.Хоробрых,Н.Л.Охотникова, В.Б.Лощенов, А.И.Волкова, К. Г. Линьков, Е.Ю.Патока, М.В.Лощенов, А. В. Бородкин, А.А. Ширяев
Кафедра и клиника факультетской хирургии им Н.Н.Бурденко, Первого МГМУ им И.М. Сеченова (зав. кафедрой академик РАН профессор А.Ф.Черноусов) Центр естественно - научных исследований федерального государственного бюджетного учреждение науки Института общей физики им. А.М. Прохорова Российской академии наук
Резюме: Проанализированы результаты спектральной лазерной флюоресцентной диагностики (ФД) у 62 пациентов: у 37 (59,7%) рак желудка, язвенная болезнь у 19 (30,6%), хронический гастрит у 6 человек (9,7%). Регистрация лазерной видеофлюоресценции осуществлена у 32 пациентов (у 24 рак желудка, у 2 язвенная болезнь, 4 пищевод Барретта, 1 полип желудка, 1 хронический атрофический гастрит (ХАГ). Исследование проводили с использованием 5-аминолевулиновой кислоты (препарат Аласенс производства ГНЦ НИОПИК), портативного спектроанализатора ЛЭСА 01 (Биоспек). Регистрацию видеофлюоресценцииосуществлили у 29 пациентов с высокочувствительной черно-белой видеокамеры с системой фильтров, у 3 –ех с использованием модернизированной двухканальной системы видеорегистрации. Коэффициент контрастности у больных раком желудка 4,55 0,2, у больных язвенной болезнь 1,08 0,7 - (разница статистически достоверна р≤0,05). Чувствительность метода составила 96%, специфичность – 78%. Отчетливая видеофлюоресценция отмечена у 21 из 24 (87,5%) больных раком желудка, и у 1 больного полипом с тяжелой степенью дисплазии. При язвенной болезни и хроническом гастрите видеофлюресценция не зарегистрирована. Лазерная флюоресцентная спектроскопия и видеофлюоресценция являются высокоинформативными методами дифференциальной диагностики заболеваний желудка и могут быть применены в качестве экспресс-методов в диагностических сложных случаях.. Ключевые слова: рак желудка, 5-аминолевулиновая кислота (Аласенс), лазерная флюоресценция, лазерная видеофлюоресценция.
Введение В последние десятилетия во многих странах мира, включая Россию, наметилась отчетливая тенденция к снижению частоты рака желудка (РЖ). Однако данная нозология продолжает занимать лидирующие позиции в структуре онкологических заболеваний и является одной из наиболее частых причин смерти от злокачественных новообразований [1,2]. Хорошо известно, что результаты лечения РЖ зависят, прежде всего, от его своевременной диагностики. Общепринятым в первичной диагностике рака желудка является применение рентгенологического и эндоскопического исследований верхних отделов желудочнокишечного тракта. Достоинства методов общеизвестны и неоспоримы. В тоже время хорошо известны и их недостатки - сложности в выявлении ранних форма рака, а также опухолей с эндофитным субмукозным характером роста. Относительно высока частота как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов при биопсии диктует необходимость повторных эндоскопических исследований и биопсий [3]. В настоящее время одним из перспективных методов ранней диагностики злокачественных опухолей, в том числе и рака желудка, является метод флюоресцентной лазерной спектроскопии [4,5]. Этот метод позволяет повысить эффективность стандартного эндоскопического исследования при раке, и оказался настолько информативным, что получил название «оптической биопсии». Различают аутофлюоресценцию, т.е. флюоресценцию эндогенных порфиринов, концентрация которых в опухолевых клеткам выше, чем в нормальных, и вторичную флюоресценцию, т.е. флюоресценцию специальных экзогенных фотосенсибилизаторов, тропных к опухолевым клеткам. Из фотосенсибилизаторов, применяемых для этой цели, следует отметить флюоресцин, флюоренат, а также производные гематопорфирина (фотофрин-2, фотосан, фотогем). Флюоресцентная диагностика злокачественных опухолей с этими препаратами высоко эффективна. Однако такая методика имеет ряд недостатков. Во-первых, применяемое в большинстве случаев излучение с длиной волны от 300 до 550 нм не проникает в ткани на достаточную глубину, что в ряде наблюдений не позволяет диагностировать эндофитный рак. Оптимальной же является длина волны 600-1200 нм (красное-инфракрасное излучение), при этом глубина проникновения в ткань достигает 3 мм. Во-вторых, фотосенсибилизаторы накапливаются не только в опухоли, но и в коже и видимых слизистых, где задерживаются длительное время. Это требует соблюдения так называемого «светового режима», при нарушении которого возникают фотодерматиты. К недостаткам регистрации аутофлюоресценции относится прежде всего невысокий коэффициент контрастности, необходимость высокоточного дорогостоящего оборудования. Новые возможности метод лазерной флюоресцентной спектроскопии получил с синтезом 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК), которая естественном образом вырабатывается в организме человека, поскольку является предшественником гема. Это соединение не является собственно фотосенсибилизатором, но индуцирует в клетках опухоли синтез и накопление фотоактивного протопорфирина IХ. Результатом этого является более интенсивная флюоресценция злокачественной опухоли относительно окружающих тканей, что обеспечивает более высокую, по сравнению с аутофлюоресценцией, диагностическую эффективность метода. Более того, интенсивность 5-АЛК-индуцированной флюоресценции столь высока, что ее можно регистрировать в опухоли не только с помощью спектроанализаторов, но и с помощью специальных высокочувствительных флюоресцентных эндоскопов, что открывает большие перспективы для клинической практики. В последние годы были созданы и начали применяться подобные устройства, в частности для проведения цистоскопии, бронхоскопии и лапароскопии. [6,7]. Однако для проведения исследования верхних отделов желудочного тракта видеофлюоресцентный гастроскоп пока не создан. Нами впервые в мире создан макет анализатора флюоресцентных изображений, совместимый со стандартным гастроэндоскопом. Цель исследования. Разработка и оценка возможностей методов лазерной спектральной и видеофлюоресцентной эндоскопии в дифференциальной диагностике заболеваний желудка.
Материал и методы Исследования проводили в Клинике факультетской хирургии им Н.Н. Бурденко, совместно с межклиническим эндондоскопическим отделением ГОУ ВПО Первый МГМУ им И.М. Сеченова» в период с 2003 по 2014гг. Проанализированы результаты спектральной лазерной флюоресцентной диагностики (ФД) у 62 пациентов, при пероральном приеме препарата Аласенс (5АЛК). По нозологическим формам больные распределились следующим образом: рак желудка - 37 пациента (59,7%), язвенная болезнь желудка – 19 (30,6%), хронический гастрит – 6 человек (9,7%). Регистрация видеофлюоресценции осуществлена у 32 пациентов (у 24 рак желудка, у 8 доброкачественные заболевания). Исследование проводили с использование препарата Аласенс, созданного на основе 5-аминолевулиновой кислоты (производство ГНЦ НИОПИК). Препарат Аласенс принимали перорально, предварительно растворив в 100-200 мл воды (10-30 мг\кг веса) за 2,5-4 часа до исследования. Кроме того, не менее чем за 2 суток отменяли антациндные и антисекреторные препараты. Система для исследования спектральной флюоресценции состояла из гелий-неонового лазера (длина волны -632,8 нм, мощность 12 мВт), портативного многоканального лазерного спектроанализатор ЛЭСА 01 (совместное производство «Биоспек» Россия и ЦЕНИ ИОФ РАН), и специального многоволоконного оптического катетера (рис.1). Предварительно перед ЭГДС со спектроскопией измеряли спектры флюоресценции кожи руки и слизистой губы пациента. Затем проводили обычное эндоскопическое исследование, в результате которого определяли подозрительные на опухоль участки слизистой. Далее диагностический катетер проводили через биопсийный канал эндоскопа к исследуемой поверхности до легкого контакта с ней (рис.1). Измеряли уровень флюоресценции в центре патологически измененного участка, в области его края и на расстоянии 1-2 см от края в реальном масштабе времени. Если интенсивность флюоресценции 5-АЛКиндуцированного протопорфирина IX (PPIX) (рис. 2) в какой-либо точке превышала аналогичное значение в визуально неизмененной слизистой (норма) в два и более раза, из этой точки брали биопсию.
Для регистрации видеофлюоресценции у 29 пациентов (рис. 3) применяли специальную насадку для стандартного эндоскопа, состоящую из высокочувствительной черно-белой камеры (0,0003 Люкса) и системы светофильтров, позволяющей выполнять исследование, как в видимом спектре (рис.3а), так и осуществлять видеофлюоресценцию (рис.3б). Для этого через специальный переходник подсоединяли волновод гастроскопа к волноводу от светодиодного лазера с длиной волны 630 нм и мощностью 1,5 Вт. У трех пациентов был использован разработанный ЗАО Биоспек видеофлюоресцентный модуль для эндоскопии и микрохирургии, который позволил производить осмотр слизистой желудка в обычном белом свете с одновременным облучением лазерным излучением и фиксацией видеофлюоресценции в заданном цвете (например, в зеленом). Помимо этого одновременно происходило измерение коэффициента диагностической контрастности (ДК), что позволяло не прибегать к спектроскопии. Установка, схематическое устройство и принцип формирования изображения представлены на рис. 4 (а,б,в).
Результаты
Диагноз «рак желудка» был установлен на основании визуальной оценки до проведения флюоресцентной диагностики (ФД) и получения данных биопсии только у 18(29,1%) пациентов. Впоследствии диагноз у этих пациентов был подтвержден как данными исследования интенсивности флюоресценции- PPIX (коэффициент контрастности 2,1-18,6), так данными гистологического исследования. Из 31 пациента с предварительным диагнозом «язвенная болезнь желудка», который предполагался на основании клинической и эндоскопической картины, у 12 (19,5%) по результатам ФД был заподозрен рак желудка. В 1-2 точках края изъязвления определена высокая интенсивность флюоресценции (коэффициент ДК 2,1-9,6). Проведена прицельная биопсия слизистой в этих точках. При гистологическом исследовании взятого материала подтвержден диагноз «рак желудка», причем у четырех пациентов из десяти выявлен «ранний» рак in situ. У остальных 14 пациентов данные ФД (коэффициент ДК 0,7-1,8) совпали с данными гистологического исследования, диагноз «язвенная болезнь желудка» был подтвержден. У 5 пациентов при ЭГДС обнаружены, так называемые атипичные, подозрительные на рак, участки слизистой. При проведении ФД у четырех из них выявлена высокая интенсивность флюоресценции 5-АЛК-индуцироаанного PPIX (коэффициент контрастности 2,1-8,0), была проведена прицельная биопсия слизистой желудка, установлен диагноз «рак желудка». У больного полипом желудка коэффициент контрастности составил 3,3, по результатам гистологического исследования выявлен рак in situ. У четырех пациентов с предварительным диагнозом «рак желудка» (по данным рентгенологического исследования и ЭГ'ДС – изменение рельефа слизистой) после проведении спектроскопии диагноз был отвергнут, что подтверждено данными последующего морфологического исследования. Установлен диагноз хронического гастрита. В 5 наблюдениях в 1-2 точках исследуемого участка слизистой желудка определялась высокая интенсивность флюоресценции 5-АЛК-индуцированного PPIX, хотя визуально эти участки не вызывали подозрений в отношении опухолевого поражения. По результатам гистологического исследования опухоль в этих участках не выявлена, однако, у четырех из этих пяти пациентов обнаружена выраженная воспалительная реакция. О повышенной генерации 5-АЛК-индуцированного PР'IX в зоне воспаления сообщают ряд зарубежных авторов [4]. Однако в 5 последних наблюдениях расхождение между результатами флюоресценции и данными морфологического исследования могут быть связаны с несовершенством методики взятия биопсии. Дело в том, что для флюоресцентного исследования использовали одноканальный эндоскоп, и биопсию, возможно, брали не точно из мест с высокой флюоресценцией, а из близлежащих точек. Учитывая сказанное, эти пациенты могут быть отнесены не к ложноположительным результатам, а к группе риска. Пациентам этой группы требуется профилактическое эндоскопическое исследование не реже одного раза в год. В одном наблюдении при ФД коэффициент контрастности составил 1,1, однако морфологическое исследование выявило высокодифференцированную аденокарциному. Этот результат относится к ложноотрицательным. В целом коэффициент контрастности составил по всей группе больных раком желудка 4,55 0,2 (от3,83 0,6 при раке In situ до 6,13 0,2 при 1У стадии). У больных язвенной болезнь коэффициент контрастности составил -1,08 0,7, при хроническом гастрите -0,98 0,9. Разница между значениями коэффициентов контрастности при злокачественных и доброкачественных заболеваниях статистически достоверна (р≤0,05). Чувствительность метода диагностики с исследованием АЛК-индуцированной флюоресценции составила 96%, специфичность – 78%. При проведении эндоскопического исследования флюоресцентных изображений желудка нами была отмечена отчетливая флюоресценция опухоли у 21 из 24 (87,5%). У 3 больных с отсутствием видеофлюоресценции было субтотальное поражение желудка, нормальная слизистая органа практически отсутствовала, что и привело к недостаточной степени всасывание препарата Аласенс)черно-бнлойкмеройгностикеасенс. Соответственно и коэффициент ДК был низок. У двух больных при комплексном обследовании диагноз рака желудка был исключен, и соответственно видеофлюоресценция отсутствовала (ложноположительных результатов не зарегистрировано). Из четырех видеофлюоресцентных исследований при пищеводе Барретта, отчетливая флюоресценция у отмечена у трех пациентов (75 %). Кроме этого зарегистрирована видеофлюоресценция очагов тяжелой дисплазии и малигнизации при использовании видеофлюоресцентного модуля (рис. 5), что было подтверждено результатами одновременной с видеофлюоресценцией регистрации спектроскопии коэффициента ДК (2,3), а в последующем и данными биопсии.
Обсуждение
Несмотря бурное развитие медицинских технологий в целом ряде случаев провести дифференциальный диагноз между доброкачественными и злокачественными изменениями в желудке бывает не просто. В связи с этим разработка новых и совершенствование имеющихся технологий является важной задачей. Одним из наиболее перспективным методом повышения разрешающей способности эндоскопического исследования является лазерная спектро- и видеофлюоресценция. Процедура эндоскопической флюоресцентной диагностики лишь незначительно удлиняет время ЭГДС (в отличие от хромоэндоскопии), а заключение о характере патологического процесса может быть сформулировано сразу в процессе проведения гастроскопии. Комплекс аппаратуры, применяемой в настоящее время для проведения ФД - достаточно компактный (портативный) и мобильный, что позволяет осуществлять его доставку в эндоскопический кабинет. Дополнительных затрат времени для специального монтажа комплекса и подготовки его к работе в условиях кабинета не требуется. Совокупность этих обстоятельств позволяет отнести ФД к разряду экспресс-методов диагностики, что повышает его ценность. Флюоресцентная эндоскопия как метод является минимально инвазивным и безопасным. Низкоинтенсивное лазерное излучение малой мощности не несет лучевой и любой другой повреждающей нагрузки, в связи с чем, при работе со спектроскопической системой не требуется дополнительных средств специальной защиты пациента и персонала. Быстрое выведение из организма 5-АЛК (препарат Аласенс) уменьшает вероятность развития токсических и световых реакций, и делает ее препаратом выбора для флюоресцентной диагностики. Высокая избирательность накопления 5-АЛКиндуцированного PPIX злокачественными заболеваниями, повышает контрастность накопления в патологически измененной ткани, что облегчает интерпретацию результатов, регистрируемых спектроанализатором, не требует специальных дорогостоящих усилителей оптического сигнала, необходимых для регистрации аутофлюоресценции. Значение КД, принятое за верхнюю границу нормы при 5-АЛК флюоресцентной диагностике – 1,7. Высокая интенсивность флюоресценции 5-АЛК-индуцированного PPIX создает возможности для развития метода видеофлюоресцентной эндоскопии в хирургической гастроэнтерологии. Первый опыт применения видеофлюоресцентной диагностики рака желудка с препаратом Аласенс (5-АЛК) продемонстрировал его достаточно высокую диагностическую точность. Метод ФД и видео-ФД показан в сложных диагностических ситуациях при подозрении на рак желудка и в силу своей простоты и безопасности в перспективе может стать стандартным этапом эндоскопического исследования. Противопоказаниями являются выраженная аллергическая настроенность организма и общепринятые противопоказания к проведению эндоскопических исследований. Нецелесообразно выполнять флюорецентные методы исследования больным с заведомо установленным диагнозом рака желудка, а так же при подозрении на тотально-субтотльное поражение органа из-за возможного нарушения всасывания препарата. Кроме того, массивные некротические изменения опухоли при запущенных стадиях рака, не позволяют осуществить полноценную спектральную и видеофлюоресцентную диагностику. В тоже время при преимущественно подслизистом характере роста опухоли, когда результаты стандартного эндоскопического исследования и данные биопсии, обычно малоинформативны флюоресцентная диагностика является весьма перспективным методом исследования. Изложенное выше, позволяет рекомендовать метод лазерной спектральной ФД с исследованием 5-АЛК индуцированного PPIX, а в перспективе и видеофлюоресценции для использования в клинике как экспрессметод диагностики, в том числе ранней диагностики, злокачественных заболеваний желудка.
Выводы 1. Разработанный метод диагностики и дифференциальной диагностики заболеваний желудка на основе лазерно-спектроскопического определения содержания 5-АЛК-индуцированного протопорфирина IX (использован препарат Аласенс) позволяет с высокой степенью точности проводить дифференциальный экспресс-диагноз заболеваний желудка, осуществлять раннюю диагностику рака и выявлять предраковые состояния.
2. Препарат Аласенс (5-АЛК) – удобный для перорального приема, не имеет специфических противопоказаний. Оптимальный интервал времени для диагностики находится между 2-4 часами от приема препарата Аласенса. Оптимальная доза препарата составляет 20 мг/кг веса.
3. Флюоресцентная диагностика с исследованием 5-АЛК (препарат Аласенс)-индуцированного протопорфирина IX является высокоэффективным, простым, безопасным методом диагностики рака желудка. В диагностических сложных случаях в перспективе может стать стандартным этапом эндоскопического исследования. Чувствительность метода составляет 96%, специфичность - 78%.
4. Разработанный метод регистрации видеофлюоресценции с препаратом Аласенс (5-АЛК) является перспективным скрининговым методом у больных раком желудка.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:
В.В. Левкин - д.м.н., профессор кафедры факультетской хирургии № 1 лечебного факультета ГУВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова. С.С. Харнас - профессор кафедры факультетской хирургии № 1 лечебного факультета ГУВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова. В.Я. Заводнов – к.м.н., заведующий межклиническим эндоскопическим отделением ПМГМУ им. И.М. Сеченова. Хоробрых Т.В. – д.м.н., профессор кафедры факультетской хирургии №1 лечебного факультета ГУВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова. Н.Л. Охотникова – к.м.н., врач-эндоскопист ГУВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова. В.Б. Лощенов - профессор, д. ф. – м. н., заведующий лабораторией лазерной биоспектроскопии ЦЕНИ ИОФ РАН. Россия 119333, Москва, ул. Вавилова, 38, тел. (499)135-1489, e-mail: loschenov@mail.ru; А.И. Волкова – вед. инженер лаборатории лазерной биоспектроскопии ЦЕНИ ИОФ РАН. Россия 119333, Москва, ул. Вавилова, 38, тел. (499)503-87-64, e-mail: volkova@mail.ru; К. Г. Линьков – к.т.н., с. н. с. лаборатории лазерной биоспектроскопии ЦЕНИ ИОФ РАН. Россия 119333, Москва, ул. Вавилова, 38, тел. (499)503-87-59, e-mail: rkir@mail.ru Е.Ю. Патока – к.м.н., врач-эндоскопист ФГУ НМХЦ им.Н.И.Пирогова. М.В. Лощенов - к.ф.-м.н., н. с. лаборатории лазерной биоспектроскопии ЦЕНИ ИОФ РАН. Россия 119333, Москва, ул. Вавилова, 38, тел. (499)503-83-39, e-mail: maxvl2000@ gmail.com А. В. Бородкин – инженер лаборатории лазерной биоспектроскопии ЦЕНИ ИОФ РАН. Россия 119333, Москва, ул. Вавилова, 38, тел. (499)503-83-39, e-mail: borodkin.aleksandr@gmail.com А.А. Ширяев – к.м.н. врач – хирург Университетской клинической больницы №1 ГУВПО ПМГМУ им. И.М. Сеченова.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Давыдов М.И. , Аксель Е.М. Заболеваемость злокачественными новообразованиями населения России и стран СНГ в 2004г. // Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, 2006, Т.17, №3, С. 45-46.; 2. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Смертность населения России и стран СНГ от злокачественных новообразований в 2004г. // Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, 2006, Т.17, №3, С. 78.; 3. Портной Л.М. Современная лучевая диагностика в гастроэнтерологии и гастроэнтероонкологии.//М. Видар-М. 2004 218с. 4. Полсачев В.И. Дооперационная флюоресцентная диагностика распространенности рака желудка. //Вестник хирургии,- 1989,- № 12, - с. 17-19. 5. Полсачев В.И. Флюоресцентный метод в дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных заболеваний желудка.//Вестник хирургии, -1992г,- № 1, -с.9597. 6. Till H, Bergman F et al. Laparoscopic fl uorescence diagnosis of peritoneal metastases from human hepatoblastoma in nude rats./ 2006 Aug;41(8):1357-1360. 7. Наrtmann A, Fuechsl K.,Kriegmair M. et al. Frequent genetic alteration in simple urothelial hyperplasias of the bladder in patients with papillary urothelial carcinoma.// Am J Pathol,1999,-154:721-727.
